High-Sensitive ECL Chemiluminescence Detection Kit (Ready-to-Use)
E412
| PN | Product Name | Size | Price (TWD) |
| E412-01 | High-Sensitive ECL Chemiluminescence Detection Kit (Ready-to-Use) |
2x50ml | 2,730 |
| E412-02 | High-Sensitive ECL Chemiluminescence Detection Kit (Ready-to-Use) |
250ml | 12,075 |
高質量的Western 顯影試劑
優化的配方，增強發光強度
抗淬滅能力強
兼容膠片曝光和CCD 掃描
本試劑盒以化學發光方法檢測蛋白質或核酸類生物大分子。蛋白質或核酸類生物大分子在電泳後轉移到印跡膜上，分別用一抗和辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP) 標記的二抗順序結合膜上的目的蛋白；或以HRP 標記的探針直接或間接結合膜上的目的核酸。洗膜後用新鮮配製的ECL 工作液，在室溫下避光孵育膜2 min-3 min，將印跡膜用保鮮膜包被粘貼固定於X 光片曝光暗盒，然後轉入暗室將X 光膠片壓在膜上曝光時長可為數秒到數小時。顯影定影后蛋白質或核酸條帶可清晰顯示在X 光膠片上，也可不進行X光膠片曝光顯影步驟，直接對印跡膜進行CCD 掃描。本試劑盒採用了獨特的發光底物系統，有效降低曝光背景、提高檢測靈敏度，並在檢測持久性和信噪比方面與ECL 增強型發光試劑盒(Vazyme #E411) 相比有顯著改善。
實驗案例
圖1. 不同品牌的ECL試劑進行Western檢測結果
本實驗設置了4個不同濃度梯度的蛋白質，Vazyme的高敏型ECL化學發光試劑的檢測靈敏度、發光強度、持久性均顯著優於競品試劑。
圖2. 不同品牌的ECL試劑進行Western檢測結果
由於T公司和B公司的試劑檢測靈敏度比較低，本實驗設置了3個不同濃度梯度的蛋白質，Vazyme的高敏型ECL化學發光試劑的檢測靈敏度、發光強度、持久性均顯著優於競品試劑，而且B公司極超敏試劑的背景值很高，影響觀察結果。
F&Q
Q1：膜上沒有信號的原因有哪些？
A1：
（1）沒有Marker或條帶很弱可能是轉膜過程出現失誤，建議更換緩衝液、排查正負電極是否插反，轉膜“三明治”順序是否正確；
（2）Marker正常：
細胞中不表達目的蛋白，嘗試換一種細胞；
細胞中的蛋白質被降解掉了，必需加入PMSF或其他蛋白酶抑製劑，抑制蛋白酶活性，並且提取過程冰上操作；
抗體或酶失活，選擇在有效期內的試劑；
抗體不能識別目的蛋白，確認該抗體是否適用於Western；
發光液與二抗標記不匹配（如AP標記不能用ECL發光液）。
Q2：目的帶很弱
A2：
（1）標本中靶蛋白含量低，可以加大樣品的上樣量；
（2）轉膜不充分，可以提高轉膜電流或延長轉膜時間；
（3）抗體效價低，可以減少抗體的稀釋倍數，增加抗體濃度。
Q3：膠片背景很髒，有什麼解決方法？
A3：
（1）膜沒有均勻浸濕，PVDF膜轉膜前應該用100%甲醇將膜完全浸濕10秒，快速激活；
（2）膜或者緩衝液污染，拿取膜與吸水紙時要戴手套，及時更換新鮮轉膜緩衝液；
（3）封閉不徹底： 延長封閉時間，4度過夜封閉可以降低背景；增加封閉蛋白濃度；更換封閉液，如BSA或Superblock；
（4）抗體與封閉劑出現交叉反應，檢測一抗、二抗與封閉劑是否有交叉反應；
（5）抗體濃度過高，增加抗體稀釋倍數；
（6）洗膜不徹底：少量多次洗滌；適當增加去垢劑強度，如Tween-20換成NP-40；
（7）蛋白上樣量太高：減少蛋白上樣量或者增加抗體稀釋倍數。
Q4：條帶過粗或過曝光
A4：
（1）減少蛋白上樣量；
（2）調整曝光時間；
（3）減少發光液孵育時間及用量（保證覆蓋整張膜），如果過曝可以用緩衝液適當洗滌後重新顯色並調整顯色的時間。
Q5：ECL使用注意事項。
A5：
（1）ECL工作液配製過程中吸取ECL Substrate A 液和Peroxide Solution B液時務必更換吸頭，工作液新鮮配製後應立即使用，室溫放置數小時後仍可使用但靈敏度略有降低；
（2）Peroxide Solution B液含有氧化劑，易被還原而失效。各溶液使用後，請蓋緊瓶蓋，以防失效；
（3）ECL發光液是HRP的顯色底物，因此檢測系統最終必須基於HRP酶標記抗體或者核酸探針；
（4）盡量避免將多張膜置於同一個洗膜盒內洗膜，相互吸附或摩擦可能造成背景增加；
（5）應使用高質量保鮮膜。質量較差的保鮮膜可能會淬滅熒光或由於含有雜質而污染印跡膜造成曝光背景值偏高；
（6）根據目的蛋白豐度不同，曝光時間可能是數秒至數小時。曝光時間不足會導致目的條帶不明確，曝光時間過長會使背景加深；
（7）疊氮化鈉（NaN3）能抑制HRP活性，若回收HRP標記探針或者抗體應避免使用NaN3，如必需使用勿超過0.01%；
（8）由於發光液極其靈敏，推薦大多數進口抗體起始濃度為一抗1:1000-1:4000，二抗1:2000-1:5000。抗體濃度過高可能造成高背景或沒有條帶；
（9）ECL Substrate A液和Peroxide Solution B液均對人體有害，操作時請小心，並註意有效防護以避免直接接觸人體或吸入體內。為了您的安全和健康，請穿實驗服並戴一次性手套操作。
Q6：ECL能否不壓膠直接照。
A6：如果使用凝膠成像儀，可以直接照。
Q7：ECL工作液怎麼配置？雙蒸水可以用ddH 2 O代替麼？有試用裝麼？可以不用X光片嗎？
A7：
(1) 新鮮配製ECL工作液：Buffer A和Buffer B按1:1混合後，用雙蒸水10倍稀釋，即為ECL工作液。須立即使用；
(2) 雙蒸水：兩次蒸餾冷凝的水；ddH2O：就是二次蒸餾水；
(3) 沒有試用裝；
(4) 建議按說明書要求，直接放到儀器裡面曝光也是可以的（把western的膜有蛋白的那面朝上，放在拍照的儀器裡面，然後把A液B液等體積混勻，滴加在膜上，使溶液覆蓋整個膜，拍照）。
說明書下載