CUT and Tag NGS Sequencing and Bioinformatic Analysis
CUT & Tag NGS Sequencing and Bioinformatic Analysis
說明
CUT & Tag（Cleavage Under Targets & Tagmentation）技術是一種研究蛋白質-DNA相互作用的新方法。
Kaya-Okur et al. 最先發表在 Nature Communications (2019) 10:1930
將單一細胞(Single cell) 使用 Protein A/G 融合的轉座酶 (Tn5, Transposase)，
在抗體引導下 精準靶向 目標蛋白，並在目的位點附近進行 DNA的片段化。
優化了實驗反應體系和建庫流程，與傳統的 ChIP-Seq 相比，
具有細胞投入量低、實驗週期短、信噪比高、可重複性好 等優勢，
尤其適用於早期胚胎發育、幹細胞、腫瘤以及表觀遺傳學等研究領域，
已經累績超過300篇以上的文獻發表。
Kaya-Okur et al. 最先發表在 Nature Communications (2019) 10:1930
將單一細胞(Single cell) 使用 Protein A/G 融合的轉座酶 (Tn5, Transposase)，
在抗體引導下 精準靶向 目標蛋白，並在目的位點附近進行 DNA的片段化。
優化了實驗反應體系和建庫流程，與傳統的 ChIP-Seq 相比，
具有細胞投入量低、實驗週期短、信噪比高、可重複性好 等優勢，
尤其適用於早期胚胎發育、幹細胞、腫瘤以及表觀遺傳學等研究領域，
已經累績超過300篇以上的文獻發表。
| CUT and Tag | ChIP-Seq | |
| 甲醛固定處理 | 否 | 是 |
| 細胞數 | 5,000-500,000 | 1-10 million |
| DNA 片段化 | Tn5 轉座酶 | 超音波 |
| 文庫製備 | 轉座酶流程建構文庫 |
無法同步進行,
IP處理完, 需回收DNA,另進行文庫建構
|
| 定序深度 | 2 million reads * | 20-50 million reads |
| 辨識區域 |
抗體特異DNA結合位
Tn5 轉座酶剪切
|
雜訊高，訊號不明顯 |
| 操作時間 | 1 天 | 2-3 天 |
Ref:
1: Kaya-Okur et al. Nature Communications (2019) 10:1930
2: Bartosovic M et al. Nature Biotechnology. (2021) 39:82
*** For less abundant targets of interest, 8 to 10 million reads are recommended
技術流程
Hyperactive Universal CUT&Tag Assay Kit for Illumina (Vazyme, TD903)
The CUT&Tag protocol consists of 3 main steps: 包括三個主要步驟
1 : 使用 Con A 蛋白, 將原生細胞(未固定的細胞)的細胞膜與核模 進行打洞通透 ;
Permeabilization of the native/unfixed cells
2 : 特異性免疫沉澱用抗體 (1st Ab) 黏合目標蛋白DNA結合區段 ;
Incubation with the specific antibody
3 : Protein G/ Tn5 融合蛋白, 進行目標蛋白DNA結合區段打斷並同步雙端接上指定DNA序列接頭 ;
Targeted tagmentation.
Permeabilization of the native/unfixed cells
2 : 特異性免疫沉澱用抗體 (1st Ab) 黏合目標蛋白DNA結合區段 ;
Incubation with the specific antibody
3 : Protein G/ Tn5 融合蛋白, 進行目標蛋白DNA結合區段打斷並同步雙端接上指定DNA序列接頭 ;
Targeted tagmentation.
送檢服務事項
建議 組合設計如下
* 細胞 實驗"控制組" 文庫: 1st Ab + 2nd Ab
* 細胞 實驗"處理組" 文庫: 1st Ab + 2nd Ab
* 細胞 實驗"控制組" 二抗單獨 文庫: 2nd Ab only
(進一步檢視2抗非特異性免疫黏合的干擾背景)
組合優惠價: 3 個文庫組合與分析 NTD 63,000
* 需要提供我們以下材料 (每樣本) :
● 細胞數 : >10^5 cells
● 1st Antibody (適合免疫沉澱用 ; Prefer monoclonal) : 2 ul 需提供 廠牌 型號
● 2nd Antibody : 2 ul 需提供 廠牌 型號
● Protease inhibitor (50x) : 300 ul 建議使用 Roche Protease Inhibitor Cocktail ; Protease Inhibitor Cocktail (EDTA-Free)
* 運送方式 : 低溫乾冰宅配寄送
* 我們會協助檢查 抗體 廠牌 型號 是否適合 Cut and Tag 實驗* 若沒有 Roche Protease Inhibitor Cocktail
實驗服務客戶 可以加購 Protease Inhibitor Cocktail (EDTA-Free) 每錠 NTD 1,260
可以配置 1ml 50X Protease Inhibitor Cocktail, 新鮮配置可最多使用5個樣本
* 我們採用TaqMan QPCR 準確定量細胞數後, 每組別各使用一萬顆(10^4)細胞進行 Cut and Tag 文庫構建
數據分析比較
生物訊息分析
標準訊息分析
1. 去接頭污染，去低質量reads和產量情況統計
2. ChIP定序序列與參考基因組序列的比對
3. ChIP定序唯一reads在全基因組的分佈
4. 統計ChIP定序數據富集區域（Peak）的信息
5. Peak相關基因篩選與GO功能聚類分析、Pathway分析
6. 多個樣品間的定量差異分析
7. UCSC genome browser使用說明
進階訊息分析
1. Binding motif分析
資料庫參考
1. TFBIND (http://tfbind.hgc.jp/)
2. Promo (http://alggen.lsi.upc.es/cgi-bin/promo_v3/promo/promoinit.cgi?dirDB=TF_8.3)
参考資料
--Martiniano M, Rodrigo M, Silin Zhong, et al. Genome-wide data (ChIP-seq) enabled identification of cell wall-related and aquaporin genes as targets of tomato ASR1, a drought stress-responsive transcription factor. BMC Plant Biol. 2014; 14: 29.
--www.strand-ngs.com
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